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细胞冻存操作方法与注意事项

发布时间:2022-12-09      点击次数:206
   我们经常遇到过这个问题:自己养的细胞开始长的还挺好的,可是冻存之后复苏会发现细胞状态不好甚至复苏不起来。出现这种问题很有可能就是你的冻存环节出了问题。
  当细胞冷到零度以下时,细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶,冰晶的大小对细胞有影响是不同的,大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂,因此就会造成我们复苏出来的细胞存活率、状态等与冻存前的状态相差甚远。那么我们要怎么解决这些问题呢?
  首先我们在冻存的过程中要减少冰晶的形成,尤其是大冰晶的形成:缓慢冻存细胞,可使细胞内避免产生大的冰晶。
  那么我们该怎样冻存细胞呢?
  一、慢冻细胞
  1、常规程序:
  使用程序降温盒
  当温度在-25℃以上时,1-2℃/min。
  当温度在-25℃以下时,5-10℃/min。
  当温度达到-100℃时,可迅速转入液氮中。
  2、简易程序:
  冷冻管管口朝上,放入纱布袋内,纱布袋系以线绳,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口,按每分钟下降1-2℃的速度,在40min内降至液氮表面过夜,次晨投入液氮中。
  3、传统程序:
  冷冻管置于4℃10min,-20℃30min,-80℃16-18h(或隔夜),液氮长期储存。
  二、低温保护剂
  常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透保护剂,可迅速透入细胞,提高细胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。
  三、细胞冻存方法
  1、预先配制冻存液:
  冻存液比例多种,根据细胞的特性进行调整冻存液的比例:
  5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基础培养液;
  2、取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗1-2次;去掉培养瓶里的残余血清;
  3、加入适量胰酶(浓度一般为0.25%),使胰酶覆盖整个瓶,放入培养箱消化;
  4、细胞消化0.5-2min(具体时间根据镜下形态判断),显微镜下观察细胞,细胞胞质回缩,细胞间不再连接成片,此时加入培养基终止消化;
  5、用巴氏吸管轻轻吹打细胞,形成细胞悬液,将细胞悬液1000r/min左右条件下离心3-5min;
  6、弃上清,加入适量预先配制好的冻存液,巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中的细胞最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
  7、将细胞分装入冻存管中,每管1-1.5ml;
  8、冻存管标记细胞名称,冻存时间,操作者及细胞代数信息。
  对于悬浮细胞冻存,则直接收集离心细胞,除去胰酶消化的步骤,其他步骤相同。
  注意事项
  1、需冻存保种的细胞应在生长良好且存活率高,其密度约为80-90%的状态。细胞冻存前应保证细胞的活力好,无污染。
  2、在细胞冻存过程中,所结的冰晶对细胞伤害较大,所以过程一定要慢。冻存或者复苏最好用新配制的培养液。
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