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细胞冻存,我们应该注意哪些事项?

发布时间:2021-09-02      点击次数:241

  有人说,养细胞像养孩子,要小心翼翼地伺候。其实不然,养细胞像养祖宗才对。孩子仍可骂可教育,但如果你对细胞粗暴一点,他会分分钟不开心,让你难堪。这么娇贵的祖宗,我建议冻存一些,有以下几个好处:
  1、留给师弟师妹们,留个好名声;
  2、避免“祖宗”挂了无储备。
  今天给大家分享一些冻存细胞的注意事项:
  1、冻存细胞的效果好坏要看细胞复苏时的存活率。细胞冻存时,细胞内部会产生晶体,水凝固形成的高浓度溶质会对细胞产生损伤,所以在冻存过程中要尽可能降低晶体的产生。为了提高复苏存活率,可通过以下方法完成:
  a.降温的速度不能太快,让细胞内的水分缓慢离开细胞;
  b.在低温环境下冻存细胞可以降低高浓度盐对细胞中蛋白质的影响;
  c.冻存试剂要采用亲水的低温保护剂;
  d.复苏时的速度要快,这样可以减少细胞内部冰晶溶解时产生的某些可溶性成分。
  2、冻存细胞是为了留种,所以要选择高浓度的细胞量进行冻存。正常情况下,当细胞浓度达到1*105/ml时即可冻存,具体是多少量主要根据个人观察。
  3、二甲基亚砜(DMSO)因为穿透细胞的能力较强,因此作为常用的冻存剂,也可以叫做细胞保护剂加入到细胞悬液中。网上有些分享说道,如果选用DMSO,整个细胞悬液的制作过程都要在4℃环境下进行。本人采用过这种方法冻存过A549和某一原代细胞,发现A549复苏存活率和正常冻存的过程相比并没有明显区别,而原代细胞的接种率确实有所上升,可能是因为是A549细胞比较皮实,这种方法更适用于比较脆弱的细胞吧。
  4、冻存液比例一般是培养基:血清:DMSO=7:2:1或5:4:1;动物种属的原代细胞冻存液可采用的比例是培养基:血清:DMSO=0:9:1,即直接用血清重悬细胞再加入DMSO,尽管如此,原代细胞的复苏成活率还是很低。
  5、有文献表明,细胞以l℃/min的速度冷冻存活率最髙,因为这一速度可以很好的控制细胞内部晶体的产生。我们实际操作不可能将速度控制的这么精确,目前惯用的就是4℃30min、-20℃1h30min、-80℃2h后转入液氮中。
  6、正常情况下,经过-20℃1h30min这一步后,冻存管内的细胞已经处于凝固状态,如果此时冻存管内还是液体,很可能是DMSO或冰箱冷冻功能出现了问题。如若遇到这种情况,不能因为时间到了,就把把液体状态的冻存管放置到液氮中,可以适当延长在-20℃环境下的冷冻时间30-60分钟,直至冻存液凝固后再放到液氮中。
  7、冻存记录要表明细胞的种类、冻存之前的状态和大致数量、冻存时间和操作者。
  8、液氮内的细胞冻存最长时间不要超过半年,冻存在液氮中的细胞应一段时间内进行更替。一个细胞系在培养一个月后,可复苏一管新的细胞确保其质量没有发生太大变化,传代几次后,再冻存留种。
  9、细胞复苏时,为保证获得较高的存活率和接种率,应尽可能的快速完成复苏,以避免在升温过程中细胞内部晶体的产生。书面介绍的复苏温度是37℃-42℃,但是本人在实际操作中发现40℃环境下复苏。
  10、复苏时的冻存管一定要密封好,以免管内外温度和压力不同导致冻存管炸裂。
  11、复苏时使用的培养基和冻存时使用的培养基中的血清尽量保证同一批次。
  12、DMSO快速稀释会对细胞造成渗透性损伤,使存活率下降50%。对于DMSO冻存的细胞,复苏后应缓慢稀释成细胞悬液:
  1.冻存液:培养基=1:1稀释成细胞悬液后离心,然后重悬至培养皿中培养,隔天换液。
  2.冻存液:培养基=1:10稀释成细胞悬液,不用离心,直接放置到培养瓶中培养2-4小时后,换液。上述两种方法都是比较常用的细胞复苏方法,后者更适用于原代细胞或比较难养的细胞。
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